摘要：为了建设口蹄疫O型病毒样颗粒疫苗规模化生产工艺，提高疫苗质量及产量、降低生产成本、提高生产效率、扩大经济效益，本文在摇瓶作育和5L酵罐作育条件下，对基因工程菌的高密度发酵和诱导条件举行优化，为gai疫苗规模化生产奠基基础。

关jian词：口蹄疫；基因工程菌；高密度发酵

口蹄疫（FMD），是由口蹄疫（FMDV）引起的偶蹄动物熏染病。天下动物卫生组织（OIE）将其列为须转达动物疫。夜淞形焕喽镆卟。gai病对畜牧业的康健生长、畜产物的收支口等方面的影响很是大。为了预防和控制FMD，我国现在使用的疫苗主要包罗灭活疫苗和合成肽疫苗，可是存在病毒扩散、灭活不完全和掩护率低等问题。口蹄疫病毒样颗粒与口蹄疫病毒有着极其相似的抗原性和免疫原性，可是由于没有病毒核酸，因此不具备熏染性。以是口蹄疫病毒样颗粒疫苗是一种新型、清静、高效的疫苗，具有辽阔的应用远景。本文主要研究了口蹄疫O型病毒样颗粒疫苗在基因工程菌中的发酵、表达工艺，为gai疫苗规模化生产奠基基础。

1 质料与要领 

1.1 试验质料

1.1.1 菌种  口蹄疫基因工程杆菌，由人生就是博尊龙生物工程集团有限公司研发中心生涯及供应。

1.1.2 主要试剂  磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、甘油、卡那霉素、氯化钠、胰卵白胨、酵母提取物、IPTG等购自国药集团。

1.1.3 主要装备  5L发酵罐系统（广州齐志生物工程装备有限公司；BF-7L），紫外分光光度计（日立；U-3900），震荡作育箱（上海知楚仪器有限公司；ZQWY-200S）

1.1.4 作育基  发酵作育基TB由人生就是博尊龙生物工程集团有限公司自制。

1.2 试验要领

1.2.1 种子制备

1.2.1.1 基础菌种的制备  将原shi菌种划线接种于含卡那霉素的LB固体平板37℃作育10~12小时，挑取巨细均一、圆润平滑的单菌落，接种于LB液体作育基中，37℃、以200~220r/min摇振作育10~12小时，作为基础种子生涯。基础种子an照规程举行磨练，应切合划定。加入甘油，-70℃以下生涯，生涯期不凌驾36个月，传代不凌驾5代。

1.2.1.2 菌种活化  由于基因工程菌菌种是在-70℃下生涯的，造成了菌种的活性低，为了提高活性，在菌种发酵作育前，需将种子在固体作育基上举行传代作育，用以zeng强菌的生物活性。将口蹄疫基因工程菌划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，在恒温作育箱中（设置作育温度37℃）作育12~14小时，平板收后放置与2-8℃冰箱生涯备用，生涯期不凌驾10天。

1.2.1.3 生产种子制备

一级种子制备  将口蹄疫基因工程菌划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，37℃作育10~12小时，挑取巨细均一、圆润平滑的单菌落，接种于LB液体作育基中，37℃、以200~220r/min摇振作育10~12小时，作为一级种子。加入甘油，-15℃以下生涯，生涯期不凌驾60日，传代不凌驾5代。

二级种子制备  取一级种子an3%接种于含卡那霉素的LB液体作育基，37℃作育8~12小时，an现行《中国兽药典》附录举行纯粹磨练，及格后作为二级种子。置2~8℃生涯，不凌驾72小时。

1.2.2 发酵作育

1.2.2.1 锥形瓶作育  将生产菌种an照响应的比例接种于含500ml LB作育基的2L锥形瓶中（接种前添加一定比例的卡那霉素），置于37℃恒温震荡作育箱中，180r/min摇振作育。当锥形瓶中的菌体浓度到达合适的OD600值时，加入适量的IPTG，在适当的温度下作育诱导表达卵白。

1.2.2.2 发酵罐发酵  将生产种子an照一定的接种量接种于发酵罐中（接种前添加一定比例的卡那霉素），37℃，30%溶氧举行发酵作育，当细菌生长至对数生长中后期时，加入适量的IPTG，在适当的温度下作育诱导表达卵白。补料方式划分接纳一ci性补料和变指数-恒pH混淆流加补料方式。在发酵历程中，每两个小时取样，测定菌液OD600值，绘制菌液的生长曲线及与菌体湿重关系的尺度曲线。

2 实验效果

2.1 锥形瓶发酵作育条件的优化  详细效果见图1和图2。

图1 菌体湿重与吸光度关系曲线

图2 工程菌生长曲线

由图1和图2可知，在接种的前6h为菌体生长的迟脱期，菌种在顺应新的生长情形而缓慢生长，在6-14h为对数生恒久，在此时代，菌体大量滋生，菌体量显着zeng加；作育到14h后，菌体生上进入平台期，菌体生长和凋亡数目保持平衡，菌体密度保持稳固，作育至22h后，细菌生上进入衰亡期，受到营养物质的不足，代谢情形的变差，细菌大量殒命，菌体密度下降。在生产历程中，为了使种子越发有利于生长，一ban选用种子活力好的时间段作为接种时间，6-14h为菌种生长对数期，此段时间种子活力最强，故一ban选对数中后期最为接种时间，综合思量其他因素，选12h菌液作为种子液。

2.2 发酵罐高密度发酵作育条件的优化  详细效果见图3和图4。

图3 工程菌发酵罐作育生长曲线

由图3可知，gai商品化作育基适合工程菌的发酵作育，菌种生长状态优异，菌体密度一连升高。gai作育基细菌生长的对数期为3h开shi直至8h竣事，然后进入较慢的生恒久，一连至12h左右进入平台期。

2.3 诱导剂用量的优化

在作育基中添加1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、10mmol/L的IPTG，然后在16℃下诱导作育18h，取样测定卵白表达量，效果批注IPTG用量为2mmol/L时卵白表达量最高（如图4）。

图4 差异诱导剂用量下的重组卵白表达量

2.4 诱导温度的优化 

将菌液划分在14℃、16℃、20℃下诱导作育18h，取样测定卵白表达量，效果批注16℃诱导时卵白表达量最高（如图5）。

图5差异诱导温度下重组卵白表达量

2.5 诱导时长的优化 

16℃下，测定差异诱导时间下重组卵白的表达量，效果批注诱导时长为18h时卵白表达量最高（如图6）。

图6 差异诱导时间重组卵白表达量

3 讨论

高密度发酵手艺现已大规模应用于重组卵白的表达生产中，本研究就口蹄疫基因工程菌高密度发酵和卵白表达的最佳工艺参数举行了探索：

3.1 从发酵罐中工程菌的生长曲线可以看出，若是作育基中营养物质足够，那么菌体密度可以到达100以上，同时活菌数可以到达1000亿cfu/ml。

3.2 种子液中含有种子zeng殖所需的种种活性酶，这些活性酶可以使菌体迅速的顺应作育基情形，提高菌体滋生速率，可以有用的缩短迟脱期。可是一旦接种量凌驾一定规模，可能会zeng加发酵的黏度，zeng加工程菌质粒丢失qing况，会严重故障重组卵白的表达，降低重组卵白的收率。若是接种量较少，则会延伸发酵的时间，从而镌汰了重组卵白的表达量。本研究进一步确定了口蹄疫基因工程菌在发酵罐中的最优接种量为2%。

3.3 在大肠杆菌高密度发酵历程中，营养物质限制了菌体生长，基础作育基中营养物质过少则大肠杆菌生长的菌体密度不能到达很高，当基础作育基中营养物质过高，高浓度的营养物质和高浓度的盐分会抑制大肠杆菌的生长。接纳补料的方式举行高密度发酵是现在最常用的方式。本研究批注，在发酵罐作育中，补料可使口蹄疫基因工程菌的高密度发酵获得乐成，变指数-恒pH值混淆流加补料方式下菌体密度OD600可到达122。因此，口蹄疫基因工程菌在发酵罐作育历程中，选用变指数-恒pH值混淆流加补料方式。